湿地生物与环境

环境DNA技术在底栖动物多样性监测中的应用及在青藏高原的实践前景

  • 杨乐 , 1, 2 ,
  • 赵姣 1, 2 ,
  • 贾亦飞 3 ,
  • 杨洪燕 3 ,
  • 普布 1 ,
  • 王蕊 1, 2 ,
  • 雷光春 3
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杨乐(1982—),男,湖南省常德人,副研究员,从事动物生态学研究。E-mail:

收稿日期: 2024-07-22

  修回日期: 2025-02-10

  网络出版日期: 2026-03-12

版权

版权所有©《湿地科学》编辑部2025
杨乐, 赵姣, 贾亦飞, 等. 环境DNA技术在底栖动物多样性监测中的应用及在青藏高原的实践前景[J]. 湿地科学, 2025, 23(2): 375-384 [Yang L, Zhao J, Jia Y F, et al. Application of environmental DNA metabarcoding for benthic diversity monitoring and its practical prospects on the Qinghai-Xizang Plateau[J]. Wetland Science, 2025, 23(2): 375-384

Application of environmental DNA metabarcoding for benthic diversity monitoring and its practical prospects on the Qinghai-Xizang Plateau

  • Yang Le , 1, 2 ,
  • Zhao Jiao 1, 2 ,
  • Jia Yifei 3 ,
  • Yang Hongyan 3 ,
  • Pu Bu 1 ,
  • Wang Rui 1, 2 ,
  • Lei Guangchun 3
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Received date: 2024-07-22

  Revised date: 2025-02-10

  Online published: 2026-03-12

Copyright

Copyright ©2025 Wetland Science. All rights reserved.

摘要

底栖动物是湿地生态系统的重要指示类群,在维持生态系统稳定和水环境监测中具有重要作用。传统的底栖动物监测主要以形态学为基础,耗时费力且难以满足大规模、高频率、高效率的底栖动物监测需求,特别是在无法实现高强度采样的青藏高原地区。环境DNA-宏条形码技术以环境DNA条形码结合二代测序技术,利用生物信息学手段对生境中的多个物种或类群进行快速、大规模鉴定。与传统方法相比,具有时效性强、准确度高、对调查对象友好及主观依赖性低等优点,已被成功应用于底栖动物和环境监测等领域。本文综述了该技术的发展历程、操作流程及其在底栖动物多样性调查与环境监测中的应用,探讨了与传统调查方法相比该技术在青藏高原恶劣环境下进行底栖动物监测的优势,并对其在青藏高原的未来应用前景进行了展望,以期为青藏高原湿地保护和管理提供参考。

本文引用格式

杨乐 , 赵姣 , 贾亦飞 , 杨洪燕 , 普布 , 王蕊 , 雷光春 . 环境DNA技术在底栖动物多样性监测中的应用及在青藏高原的实践前景[J]. 湿地科学, 2025 , 23(2) : 375 -384 . DOI: 10.13248/j.cnki.wetlandsci.20240197

Abstract

Benthic animals play a crucial role as bioindicators of wetland health, significantly contributing to ecosystem stability and serving as essential components in the monitoring of aquatic environments. These organisms respond sensitively to environmental changes, making them valuable for assessing the ecological status of freshwater and marine habitats. Their presence, diversity, and abundance can reflect water quality, pollution levels, and overall ecosystem health. However, traditional benthos surveys rely heavily on morphological identification, a method that is not only time-consuming and labor-intensive but also requires specialized taxonomic expertise. Conducting large-scale, high-frequency, and high-efficiency benthic surveys is challenging, particularly in remote and ecologically sensitive regions such as the Qinghai-Xizang Plateau. The extreme environmental conditions of this region, including high altitude, low oxygen levels, severe temperature fluctuations, and rugged terrain, further complicate field sampling, making it difficult to obtain comprehensive and timely data on benthic biodiversity. In response to these challenges, environmental DNA (eDNA) metabarcoding has emerged as an innovative and highly effective tool for biodiversity assessment and environmental monitoring. This technique utilizes high-throughput sequencing to analyze genetic material present in environmental samples such as water and sediment. By targeting specific DNA barcodes, eDNA metabarcoding allows for the rapid and accurate identification of multiple species or taxa without the need for direct specimen collection or extensive taxonomic expertise. Compared to traditional survey methods, eDNA metabarcoding offers several advantages: it is faster, more precise, non-invasive, and highly objective. Moreover, it enhances the detection of rare, cryptic, or elusive species that may be overlooked using conventional sampling techniques, thereby improving the comprehensiveness of biodiversity assessments. The application of eDNA metabarcoding in benthic biodiversity assessment has gained significant attention in recent years. This approach has been successfully implemented in various aquatic ecosystems, including freshwater, marine, and wetland habitats, to monitor species composition, track invasive species, and assess the impacts of environmental changes. On the Qinghai-Xizang Plateau, where extreme conditions and logistical constraints hinder traditional survey efforts. eDNA metabarcoding presents a groundbreaking alternative for efficient and reliable biodiversity monitoring. By overcoming the limitations of conventional methods, this technology provides a more effective way to understand and protect fragile wetland ecosystems. This paper explores the development, methodologies, and applications of eDNA metabarcoding in benthic biodiversity assessments and environmental monitoring. It highlights the advantages of employing this technique under the harsh environmental conditions of the Qinghai-Xizang Plateau and discusses its future potential. By integrating eDNA technology into wetland conservation strategies, researchers and policymakers can make better-informed decisions to ensure the sustainable management and protection of these critical ecosystems. Ultimately, this study aims to contribute to broader ecological conservation efforts and environmental management initiatives on the Qinghai-Xizang Plateau.

当前全球变化的速度已超越地球自现代类型海陆生态系统形成以来任何时期的自然变率,跨越了生态系统可适应的临界点[1]。人类活动导致大气CO2浓度急剧上升,引起全球变暖、极端气候频发、水循环重组等重大环境变化[2],生物多样性有可能进入一个明显的下降期[3],面临着严重威胁和挑战。保护生物多样性、维持生态环境健康已成为全球环境治理和中国生态文明建设的主要任务。湿地因其对气候变化的敏感性,在气候变化研究中发挥着重要作用[4]。青藏高原是中国重要的湿地分布区,同时也是地球各圈层相互作用最为强烈的地区之一,目前该区湿地退化严重,生物多样性受迫[5]。青藏高原高寒湿地数量众多,作为全球变化的敏感地带,保护其生物多样性及湿地生态系统健康尤为重要,因此青藏高原生物多样性调查与环境监测工作刻不容缓。
底栖动物作为湿地生态系统的一个重要组成部分,是维护湿地生态系统结构与功能完整性的重要生物类群。底栖动物不仅在物质循环和能量流动中起着承上启下的重要作用[6],还可通过捕食、钻穴等活动在一定程度上改善水体环境[7],一些物种还能通过羽化将水体中过多的氮磷带离水体[8]。底栖动物具有物种多样性高、生命周期较长、迁移能力较弱、分布范围广以及对环境变化敏感等特点,是国际上广泛应用的水环境质量指示生物类群[9]。底栖动物多样性监测是环境保护和制定生态保护对策的基础工作之一,但当前关于青藏高原底栖动物多样性现状的了解严重缺乏数据支撑,另外,受地区性人类活动和全球气候变化等的多重影响,青藏高原底栖动物多样性下降的风险越来越大,单纯依靠传统的监测方法、形态学鉴定手段,难以满足短期内大规模、高频率、高效率的监测需求。
环境DNA(environmental DNA,eDNA)是指从土壤、冰川、沉积物或水体等环境中直接提取到的DNA片段的总和,主要包括不同生物体释放到环境中的胞内DNA和细胞裂解或死亡后的胞外DNA[10]。当前基于eDNA条形码结合二代测序形成的eDNA-宏条形码技术(eDNA metabarcoding,以下简称eDNA技术)能快速得到环境中多个物种的信息,可用于揭示历史和当下环境中的生物多样性信息[11],该技术具有快速、可重复、灵敏度高、通量高、结果标准化等优点,为生物多样性调查提供了高效有力的方法。目前在生物多样性监测中应用越来越广泛,例如对爬行类[12]、两栖类[13]、鱼类[14]以及底栖动物[15]等的监测。传统底栖动物监测方法的缺陷使其难以满足青藏高原底栖动物监测的需求,eDNA技术凭借其在监测底栖动物方面的优势,未来可成为青藏高原底栖动物多样性监测的重要手段。目前eDNA技术仍在优化阶段,还不能全面替代传统方法,主要应用于快速监测底栖动物多样性、目标物种监测、物种生物量估测以及水生态健康评估等。
本文系统总结了eDNA技术的发展历程、操作流程及其在底栖动物监测中的应用,探讨了与传统调查方法相比该技术在青藏高原地区进行底栖动物监测的优势,并展望了该技术在青藏高原等恶劣条件下进行底栖生物多样性监测的前景,以期为高原湿地保护和管理提供参考。eDNA技术的发展结合传统调查方法将推动青藏高原生物多样性监测进入一个崭新的时代,为全球生物多样性监测及湿地保护和管理做出卓越贡献。

1 eDNA技术的发展历程与操作流程

1.1 eDNA技术发展历程

1987年Ogram首次从湖泊沉积物中提取出微生物DNA[16],21世纪初eDNA开始被引入生态学领域[10]。2003年Hebert首次提出了DNA条形码(DNA barcodes),通过DNA条形码可以进行生物鉴定[17]。得益于测序技术的进步,从第一代测序发展到第二代高通量测序[18-19],eDNA技术从小尺度上对单个物种的检测向大尺度上对多物种的检测发展,由此形成了较为成熟的eDNA技术,能一次性对样品中的多个物种或类群进行快速、大规模鉴定[11]
eDNA技术首先应用于微生物研究,后来逐渐拓展到从沉积物、水、冰、土壤等自然介质中分析哺乳动物、鸟类、水生生物等生物群落的变化。2008年eDNA技术第一次被作为工具监测淡水生物,从水中提取eDNA监测到了美洲牛蛙(Lithobates catesbeiana)[11]。2012年,研究者开始尝试利用eDNA技术探究鲤鱼(Cyprinus carpio)在水域中的分布情况及生物量[20],进而实现了该技术由定性到定量的转变。在底栖动物方面,2011年Hajibabaei首次证明eDNA技术适用于底栖动物多样性监测[21],随后的研究进一步证实了该技术对环境敏感类群——蜉蝣目(Ephemeroptera)、襀翅目(Plecoptera)、毛翅目(Trichoptera)(即EPT昆虫)物种有良好的检出效果[22]。目前,对大部分底栖动物的检出率较高,总体检出率达98%,其中EPT昆虫的检出率高达100%[23]。目前,关于该技术多用于快速监测底栖动物多样性、目标物种分布及生物量,从而进一步评估水生态健康[24]

1.2 eDNA技术操作流程

eDNA技术的一般操作流程主要包括eDNA样品采集、eDNA富集、eDNA提取、PCR扩增、eDNA分析等步骤(图1),其中最核心的步骤是eDNA样品的收集与处理,其直接决定了后续流程和结果的准确性。目前多数研究取水量为0.5~1.0 L,设置2~3个重复,采样时避免污染[25-26];富集时根据样品情况选择不同孔径、不同材质的滤膜,多采用0.22~0.45 um的纤维滤膜[25];不同提取方法得到的eDNA量差异较大,目前CTAB-PCI提取方法较好[27]。选取合适的分子标记与扩增引物是eDNA扩增成功的关键,对于不同生物类群选择的引物有所不同,目前底栖动物监测多使用CO1条形码片段的通用引物,扩增出的序列经测序后得到大量包含分类学信息的数据,由此数据即可分析出监测结果[10,21]。此外。还需要注意eDNA污染引起的假阳性,在采样中要避免污染或采用环境RNA技术来减少污染[26]
1 The basic workflow of environmental DNA metabarcoding

环境DNA-宏条形码技术的一般操作流程

2 eDNA技术在底栖动物多样性调查与环境监测中的应用

2.1 底栖动物多样性快速监测

生物多样性监测是获得物种及其群落组成和时空分布变化的重要手段,可为生物多样性保护与栖息地管理策略的制定提供关键数据。eDNA方法在理论上能够快速得到更丰富的物种多样性信息[28],可以准确识别几乎所有的底栖动物,对于丰度仅超过1%的物种也能够很好地监测[21]。该技术时效性强,有研究人员基于eDNA技术在2天内完成了悉尼港海岸线34个样点的底栖动物多样性调查,而传统方法需耗时1~2周[29]
Vincent等[30]对双壳类进行多样性监测发现,通过eDNA技术检测到的物种数总是大于或等于传统方法检测到的物种数,通过传统方法观察到的物种在eDNA方法中都得到了很好的验证,且eDNA方法的检出率比传统方法平均提高了1.33倍,而只考虑活体时,eDNA方法的检出率要高出2.11倍。其他研究同样证实了传统方法的检测结果严重低估了底栖动物群落多样性水平[31]。传统监测方法主要是利用现场调查,采用形态学方法进行物种鉴定,对于取样容易、个体较大的物种来说效果较好,然而底栖动物体型较小,且相近种难以辨别。在许多环境中,对于某些特定生命阶段和密度非常低的群体,现场取样非常困难[32],使其多样性被严重低估。然而,有研究将eDNA技术应用于底栖动物指示物种监测,发现利用该技术与利用传统方法的监测结果有较好的一致性[33]。Laura等[34]使用两种方法监测贻贝物种数量,也发现eDNA方法与传统方法的结果基本一致。在中国,eDNA技术被应用于多个地区底栖动物多样性的快速监测,如秦淮河[35]、海珠湖[36]等。可见,eDNA技术为底栖动物多样性监测提供了一种快速、高效益、非侵入性采样方法。青藏高原气候持续“暖湿化”,加剧了湿地面积的减少和部分生物栖息地的退化[37],亟须对其生物多样性的变化进行有效监测,而传统方法难以支持大尺度、标准化、精准的生物多样性监测,eDNA技术在快速监测青藏高原底栖动物多样性方面具有巨大应用潜力。

2.2 目标物种监测

eDNA技术通过判断水体中是否有目标物种释放的DNA来检测水体中是否有该物种的存在,在此方面已有较多的应用,如濒危物种、指示物种及入侵物种等的检测[14]。Klymus等[38]应用该技术进行淡水贻贝的监测对其类群保护工作具有重要意义,大多数研究采用传统方法监测到的数据在eDNA方法中都获得了验证[39]
目前,eDNA技术在目标物种监测方向应用最广泛的是对入侵物种的监测。入侵生物会导致生物多样性丧失和全球同质化,入侵成功后控制成本高且根除极其困难[40]。例如2016年在青藏高原地区发现13种非本地鱼类入侵西藏拉萨河,对本土鱼类造成了严重威胁[41],黑斑蛙(Pelophylax nigromaculatus)作为入侵物种在林芝和拉萨被发现[42],而拉鲁湿地也已检测到红耳龟(Trachemys scripta elegans)[43]、美洲牛蛙[44]等恶性外来物种的分布。识别外来物种的起源对于有效控制外来物种的传播具有重要意义,在早期阶段,外来物种的种群密度较低,清除容易,但传统方法难以及时发现,而eDNA技术以其高灵敏度和高效性极大增加了外来物种在入侵早期阶段被发现的可能性,更易于防治。eDNA技术首次应用于入侵物种研究,是2008年Ficetola从水体中检测到外来入侵物种美洲牛蛙,从而发现eDNA技术可以快速有效地检测出低密度物种[11]。随后有研究者利用两种方法同时调查水环境中是否存在牛蛙,发现eDNA技术在曾观察到牛蛙存在的水体中检测成功率为100%,甚至在传统方法没有观察到牛蛙的水体中也发现其存在[45]。此外,eDNA技术应用最为成熟的案例是检测鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis)和鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)在北美五大湖的入侵情况,该研究已被用于指导该入侵鱼类的去除工作[29,46]
在底栖动物入侵方面,通过eDNA技术在鄱阳湖监测到福寿螺(Pomacea canaliculata),而传统方法未能发现[39]。Ardura等[47]在太平洋里海地区监测到了斑马贻贝(Dreissena polymorpha),比传统捕捞方法提前几个月发现了入侵迹象,后来采取有效措施遏制了其进一步扩散。Hiraoka等[48]的研究有效防止了日本各地入侵性虾类的生态破坏。此外,对新西兰泥螺(Potamopyrgus antipodarum)[49]、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)[50]等的相关研究也证实了eDNA技术监测入侵物种的优势。eDNA技术还可以检测到物种是如何、何时入侵的,如泥螺(Peringia ulvae)通过压舱水进入遥远的海洋区域,最终可能成为入侵物种[51]。Blackman等[52]通过研究入侵蚌类eDNA的降解速率初步判断其入侵时间。可见,凭借更高的灵敏度,eDNA技术能够在低丰度早期发现入侵物种、检测入侵物种的传播媒介和途径,为青藏高原提供了一种非侵入性识别入侵物种的方法,对青藏高原生物多样性保护研究具有重要意义。

2.3 物种生物量估测

生物量能够提供更完整的信息来进行生态学及生物学研究,但其很难被精确估测,尤其是水生生物[20]。底栖动物体型较小、数量和种类丰富,利用传统方法监测时会造成生物损伤及栖息地破坏,导致生物量的评估十分困难。通常水体中生物eDNA的浓度与生物量呈正相关关系,研究者们依此开展了水体中生物种群密度和生物量的估测研究,主要应用于鱼类、两栖动物和软体动物[20,53]。首次应用为Takahara[20]对鲤鱼(Cyprinus carpio)进行生物量的量化分析,结果表明水体中eDNA浓度与鲤鱼生物量呈正相关,并且基于eDNA浓度得到的生物量数据能推测鲤鱼的潜在分布情况。随后有研究发现,在珍珠蚌(Margaritifera margaritifera)数量最多的地方,其eDNA浓度也最高[54]
在中国,王兴春[55]最早提出样品中某种DNA被测序的次数可以反映该序列在样品中的丰度,即eDNA技术具有定量功能。在随后的应用中,李苗等[56]建立了中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)生物量评估的eDNA检测技术,为后续中国对虾的分布监测及生物量评估奠定了基础。还有研究结合中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)亲蟹资源调查数据,建立了eDNA浓度与单位努力渔获量(CPUE)之间良好的相关关系[57]。但目前eDNA技术对任意物种的定量估测还较为困难,且eDNA的浓度受到很多条件的影响[58],因此倡导增加环境RNA技术在生物监测和生态系统监测中的应用,提高生物量估测能力[59]。综上,利用eDNA技术可以在青藏高原开展物种生物量估测,从而很好地弥补传统调查方法在此方面的欠缺。

2.4 水生态健康评价

eDNA技术还可应用于水生态健康评价。欧洲水框架指令(WFD)指出,对底栖动物的监测可用于水域生态评估,从成本效益和环境影响出发,采用eDNA技术可取代传统方法进行水域健康评价[59-60]。底栖动物群落是许多环境监测项目的核心指标,在湿地生态系统中,底栖动物被收集、鉴定,进而用来推断生态系统状况,如颤蚓科Tubificida、摇蚊科Chironominae等底栖动物可作为富营养水体的指示种[8]
Carew等[22]通过eDNA技术成功将底栖动物鉴定率提高到99%,证明eDNA技术可以对湿地生态系统进行常规的物种级诊断监测。在应用eDNA技术对太湖流域进行生态健康评价时,研究者发现底栖动物完整性指数B-IBI与形态学方法显著相关[61]。如能将eDNA技术应用于青藏高原湿地的常规监测中,可快速评估湿地健康状况,这对于完善青藏高原底栖指示生物群落和生态环境评估体系具有重要意义,同时也为进一步保护青藏高原湿地提供科学依据。eDNA技术能够快速大规模地得到物种多样性和群落组成信息,为底栖动物多样性调查与环境监测提供了新工具(表1)。
1 Examples of application of environmental DNA (eDNA)metabarcoding in benthic monitoring

eDNA技术在底栖动物监测中的应用研究示例

监测类群 年份 基因标记 引物序列(方向5'-3') 应用
底栖动物[21] 2011 CO1 LepF1:ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG
EPT-long-univR:AARAAAATYATAAYAAAIGCGTGIAIIGT
底栖动物多样性快速监测
摇蚊属[22] 2013 CO1 HCO2198:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
LCO1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
COI A for:CCHCGAATAAATAATATAAGWTTYTG
911:TTTCTACAAATCATAAAGATATTGG
指示物种多样性快速监测
CytB CB1:TATGTTTTACCATGAGGACAAATATC
CB322R:GGRTTDGCDGGRATRAARTTATC
CB549R:TTCTACDGTDGCHCCAATTCA
T-N-S1:TATITCTTCTATGTITTCAAAAC
夸加贻贝[31] 2020
COI DRB1_F:GGAAACTGGTTGGTCCCGAT
DRB1_R:GGCCCTGAATGCCCCATAAT
入侵物种监测
底栖动物[35] 2022
COI mlCOIintF:GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
mlCOIintR:GGRGGRTASACSGTTCASCCSGTSCC
底栖动物多样性快速监测
底栖动物[36] 2023
18S rRNA 528F:GCGGTAATTCCAGCTCCAA
760R:AATCCRARAGAATTTCACCTCT
底栖动物多样性快速监测
贻贝属[38] 2021 CO1 PfaCOI2_Degen_F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGKCTTTTRATTCGDGCTGA
PfaCOI2_Degen_R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAGTHCCAACACCHCTCTC
ND1_Mini_F4_Degen:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAMTYCGAAARGGYCC
ND1_Mini_R1_Degen:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTCARCCTGYTATDARDGT
目标物种
监测
福寿螺[39] 2024 16S rRNA 16Sar-L:CGCCTGTTTATCAAAAACAT
16Sar-H:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT
入侵物种监测
甲壳纲[48] 2021 CO1 PS_COI_F:CCCCCTCACTCACCCTTC
PS_COI_R:GTTCGATCT ATCGTTATTCCTGGTCTTC
入侵物种监测
欧洲泥螺[51] 2015 CO1 Uni-MinibarR1:GAAAATCATAATGAAGGCATGAGC
Uni-MinibarF1:TCCACTAATCACAARGATATTGGTAC
入侵物种监测
珍珠蚌[54] 2017 CO1 F:TTGTTGATTCGTGCTGAGTTAGG
R:GCATGAGCCGTAACAATAACATTG
物种生物量
估测
中国对虾[56] 2019 CO1 CO1-F:TCTGATTATCCTGACGCCTATG
CO1-R:AAGATTACTGGGCGATTAGAAAC
CO1PF:TTGTAGTTACAGCCCACGCT
COIPR:AAATTATCCCGAAGGCGGGT
物种生物量
估测
中华绒螯蟹[57] 2024 CO1 COI DF:AGGGGTAGGAACAGGATGAAC
CO I D:RGACACCAGCTAGATGCAGCG
物种生物量
估测
底栖动物[61] 2022 CO1 LCO1490F:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HC02198R:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
水生态健康
评价

3 eDNA技术监测青藏高原底栖动物多样性的优势与局限性

青藏高原作为中国乃至亚洲的重要生态安全屏障和全球生物多样性保护的热点地区[37],气候变化和不断增强的人类活动加剧了湿地退化,因此保障青藏高原生态安全已成为生态保护的重中之重。但由于地区偏远、环境恶劣等因素,青藏高原水生生物研究相对薄弱,研究类群主要是鱼类,对原生动物、甲壳动物等无脊椎动物的研究较少,对底栖动物的研究更为不足,已有的底栖动物研究包括对那曲市盐湖[62]、雅鲁藏布江[63]、柴曲藏布流域[64]等地的调查,均采用传统方法,在研究内容上侧重于传统分类学和宏观生态学。
未来可利用eDNA技术的优势,在以青藏高原为例的高寒湿地开展底栖动物多样性监测,全面预测全球气候变化的生态影响,并采取有效的管理措施,保护高寒湿地生态,以避免产生不可逆转的生态后果。目前eDNA技术在青藏高原湿地主要应用于浮游植物[65]、微生物[66]、细菌[67]、鱼类[68]等类群,对底栖动物的研究较少。有研究人员在南科湖支流[69]、帕隆4号冰川融水溪流和下游然乌湖[70]监测了栖息在受冰川影响的水文连接栖息地中的底栖动物群落结构,以及不同底栖动物类群的适应性,由此提供了底栖动物对全球变化响应的证据。在羊卓雍错的eDNA相关研究中,底栖动物群落的时间动态分布表明[71],该湖从2004年开始表现出持续的富营养化过程且一直在加速,而营养富集主要归因于集水区的人为排放。应用eDNA技术对澄海湖近170年生物多样性变化的相关研究,则增进了我们对水生生物应对环境变化长期动态的全面理解[72]
综上所述,eDNA技术作为一种新的监测手段,在底栖动物研究中被广泛应用。传统以形态学为基础的调查方法极具劣势[21,29],因此,eDNA技术为青藏高原底栖动物多样性监测提供了一种简单、快速和友好的方法。相较于传统方法,eDNA技术应用于青藏高原具有显著优势:第一,青藏高原海拔高、紫外线强、温度低等严酷自然条件,使得应用传统方法调查极其困难,而利用eDNA技术在野外只需采集水样,且采样方法简单,无须高强度野外工作;第二,eDNA技术灵敏度高。青藏高原存在外来物种入侵的问题,对于还未入侵成功的低密度物种,利用传统方法难以监测到目标种,但利用eDNA方法则可以很容易监测到该物种;第三,对生态系统干扰低。传统方法会对目标物种和其他生物造成伤害,甚至破坏生态系统,而eDNA技术对生物及生态系统友好,适用于脆弱的青藏高原湿地生态系统;第四,采样受限小。不良天气状况、水位变化等环境条件对采样的影响和限制被最大限度地降低,在青藏高原极端天气、环境艰苦等条件下,也能有效进行生物多样性调查;最后,该方法克服了传统方法通过物种形态学特征鉴种的局限性,同时对调查人员的要求降低,eDNA技术仅依靠分子生物学的方法便可完成生物调查。因此,eDNA技术在青藏高原底栖动物多样性调查与环境监测中具有良好的应用前景。
尽管如此,目前eDNA技术仍存在一定的局限性。首先,环境中eDNA的量由它的产生和降解情况共同决定,且生物释放的eDNA会随着水流迁移一段距离[10,58],其检测结果的精度有待提高;其次,由于污染、抑制剂、非特异性扩增等造成的假阳性或假阴性将会影响eDNA技术的准确性[27],结果准确性也有待提高;最后,参考数据库的完整性和质量直接决定了运用eDNA技术进行物种鉴定的可靠性,目前参考数据库中底栖动物相关序列匮乏,且现有的数据库中存在诸多错误信息[40]。针对这些局限,在应用eDNA技术进行青藏高原底栖动物多样性监测工作时,应深入了解底栖动物eDNA在水体中的代谢分析,提高检测结果的准确性以及基于eDNA估测物种生物量的能力;应 进行设备创新、流程优化、开发新引物、利用eRNA技术以及控制污染,提高eDNA技术的准确性;最重要的是建立完善的本土物种数据库,目前底栖动物常用的公共参考数据库主要有NCBI、EMBL、BOLD、FISH-BOL等。鉴于上述数据库中大量错误信息的存在与底栖动物CO1基因序列的极度匮乏,当前亟需建立可靠规范的底栖动物条形码参考数据库,减少检测结果中的未知分类操作单元,做到数据中每条序列均能找到其出处以及对应的标本,这将进一步促进eDNA技术在底栖生物多样性调查各领域的应用。同时,应在青藏高原区域的关键湖泊开展应用eDNA技术的长期监测,以更加准确地反映青藏高原水环境的变化及趋势。
由于上述限制,目前eDNA技术无法完全替代传统方法,因此eDNA技术应被视为传统方法的补充而不是替代品,可作为一种重要的补充工具来监测青藏高原底栖动物群落。使用eDNA技术可以帮助我们在这个地域偏远、环境恶劣的生态重要地区对底栖动物进行更多研究。将eDNA方法与传统方法相结合,利用各自优势互补可以进一步拓展该技术在底栖动物监测中的应用,为高寒湿地底栖动物多样性监测及湿地保护提供有力技术支撑。

4 eDNA技术的应用前景与展望

全球气候变化等原因加剧了青藏高原、喜马拉雅山脉等地的暖湿化趋势,且由于人类活动的间接影响,地区生物多样性及其栖息环境变化快速,亟需开展大规模、高频次的生物多样性调查。eDNA技术作为底栖动物多样性调查监测的有力工具,时效性强、准确度高,同时具有生物友好性,能够最大限度地减少栖息地破坏,并可以通过单次采样评估生境多样性,极具成本效益,可为高寒湿地等恶劣环境中底栖生物及其群落动态研究提供更好的方法。随着技术的不断进步,作为一种高效且易于标准化的监测方法,eDNA技术将会彻底改变生物多样性监测的方法,通过在高度确定的空间和时间尺度上进行广泛的分类物种的近实时普查。
当前,鉴于该技术还存在一定的局限性,即eDNA时空的不确定性、eDNA技术的不准确性、参考数据库的不完整性,eDNA技术并不能完全取代传统方法。今后我们需要深入了解底栖动物eDNA的动态模型,提高检测结果的精度,并注意污染问题,同时建立可靠规范的本土底栖动物条形码参考数据库,进一步促进eDNA技术在底栖动物监测等领域的应用。如何优化和拓展其在底栖动物监测中的应用将是今后研究的重点,研究者们有必要研究制定eDNA技术的标准化操作规程和方法,规范其在底栖动物监测中的应用。
综上,eDNA技术对于生物多样性调查研究而言是一个十分有效的工具,需要将其与传统方法相结合,为底栖动物监测及多样性保护提供有力技术支撑,进一步拓展该技术在高寒湿地等偏远生境生物多样性保护领域的应用,为促进生物多样性保护和预测气候变化对湿地的影响提供科学依据。目前全球都面临着生物多样性退化的形势,在全球范围内广泛应用及推广eDNA技术,将有助于认识和完善生物多样性分布规律及监测全球气候变化对生物多样性的影响。
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