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2025 , Vol. 23 >Issue 1: 190 - 200

DOI: https://doi.org/10.13248/j.cnki.wetlandsci.20240053

Effects of using imazapyr to remove Spartina alterniflora on soil microbial communities

  • Yang Jingjun ,
  • Qin Jie ,
  • Tian Hongdeng ,
  • Xia Jialang ,
  • Wei Haihang ,
  • Liu Xiu , *
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Received date: 2024-03-04

  Revised date: 2024-05-16

  Online published: 2026-03-12

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Abstract

In China, the control of Spartina alterniflora in a chemical way is in its initial stage, and the effects of chemical drugs on ecosystems during use are not well understood. In order to provide a scientific basis for using imazapyr to remove S. alterniflora, we investigated the temporal dynamics of soil microbial communities in the experimental plot (sprayed with 25% imazapyr aqueous solution, 17.91 L/hm2) and the control plot (not sprayed with the imazapyr). The results showed that there was no significant difference in soil microbial diversity between the experimental plot and the control plot, but there were significant differences in soil microbial diversity at different times under the same treatment. Imazapyr only affected the relative abundance of a samll group of microbes (e.g., Actinobacteriota, Zygomycota, etc.). In the first 6 days after spraying imazapyr, the bacterial community structure changed greatly, but the imazapyr had no significant effect on fungal community structure. There was no significant difference between experimental plot and control plot in the proportion of metabolic pathways of bacterial community, but there was a significant difference in the proportion of metabolic pathways of fungal community. The proportion of common significant difference metabolic pathways of bacteria in the experimental plot and the control plot had a similar trend with time changing, while fungi were the opposite. In conclusion, imazapyr had little effect on soil microbial diversity, and it mainly affected the bacterial community structure ranther than fungal community structure, while fungal community function was more affected by imazapyr than the bacterial community.

Cite this article

Yang Jingjun , Qin Jie , Tian Hongdeng , Xia Jialang , Wei Haihang , Liu Xiu . Effects of using imazapyr to remove Spartina alterniflora on soil microbial communities[J]. Wetland Science, 2025 , 23(1) : 190 -200 . DOI: 10.13248/j.cnki.wetlandsci.20240053

互花米草(Spartina alterniflora)是一种多年生盐生植物，具有很强的生态适应性和繁殖能力[1-2]，原产于北美洲大西洋沿岸及墨西哥湾，于20世纪70年代末被引入中国东南沿海地区[3]。至2023年，互花米草快速持续扩张，其分布面积已经达到了680.0 km2[4]。互花米草与土著植物竞争，迅速抢占生态位[5]，导致土著植物生物量和多样性降低[6]，土壤理化性质、微生物群落、碳循环过程[7]以及潮沟形态[8]发生改变。同时，对海岸带环境造成了极大的破坏，导致沿海经济发生巨大损失。因此，早在2003年中国已经将互花米草列入入侵物种名单[9-10]，如何科学有效地治理互花米草迫在眉睫[4,11]。
目前，治理互花米草的方法主要有机械深翻填埋、人工刈割、遮阴覆膜、引入天敌控制和种植替代等[12-15]，但治理效果不尽如人意，有些方法的治理成本高，治理周期长，有些方法则对环境影响较大[16]。相比之下，通过化学方法在滨海湿地治理互花米草的周期短、效果显著，而咪唑烟酸(Imazapyr)是使用最广泛的化学药剂之一[17-18]。中国海岸线长，地形、气候复杂，使用咪唑烟酸除草剂去除互花米草可能造成的环境影响尚不明晰，故在中国还未大规模使用咪唑烟酸除草剂去除互花米草。为探究低风险、低成本、高效能的互花米草治理方法，利用咪唑烟酸治理互花米草已经在全国范围内展开了不少实验试点，其中在福建漳江口的试验中治理效果显著，对环境的影响较小[3]。
土壤微生物在海岸带生态系统的形成、演化、稳定和生态功能中起着重要作用，与河口湿地环境和元素生物地球化学循环密切相关[19-21]。土壤微生物能对外部环境的变化做出快速响应[20-21]。微生物群落组成受pH、盐度、有机碳供应和植物–微生物相互作用等多种因素的影响[22-24]。因此，咪唑烟酸的施用有可能直接影响微生物群落，也可能通过去除互花米草而间接影响微生物群落。此外，除了受特定因子的影响外，微生物群落结构本身在时间尺度上存在一定的变化过程(演替)。在自然界中，环境条件会随着时间的推移而发生变化，例如季节变化(温度、水分等)会导致微生物群落发生具有一定变化规律的演替[25]。在这种演替模式下，微生物群落结构可能不会因为除草剂的施用而受到影响[16,19]。微生物多样性和群落结构均与其群落功能紧密相关，而微生物群落功能的变化反应了微生物群落对环境变化的响应[26]。尽管生态系统功能与植物入侵之间的关系日益受到关注，但是关于入侵植物治理过程中土壤微生物群落结构和功能的时间动态特征尚未得到深入研究。
本研究在广西壮族自治区北海市山口红树林生态国家级自然保护区，开展为期120 d的施用咪唑烟酸除草剂治理互花米草的野外实验，比较对照组与施用咪唑烟酸除草剂治理互花米草对土壤微生物(细菌和真菌)多样性、群落组成和功能的时间变化的影响，旨在为科学合理治理互花米草提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 研究地点

实验样地位于广西山口红树林生态国家级自然保护区内(109°37′00″E~109°47′00″E，21°28′22″N~21°37′00″N)。保护区属亚热带湿润气候，年平均气温22.9 ℃，年平均降水量1 573.4 mm，潮汐为全日潮，平均潮差为2.45 m。保护区海岸线长50 km，当地的天然红树林发育良好、结构典型、面积大，但目前受到互花米草入侵的威胁。在潮间带区域选择1 hm2的互花米草群落作为实验样地，涨潮时海水会淹没互花米草，互花米草平均密度为302.33株/m2，平均高度为40.92 cm，盖度约90%。试验样地内有零星分布的木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、白骨壤(Avicennia marina)等红树植物。

1.2 实验设计

2022年5月(互花米草生长旺期)，在互花米草分布密集区域设置2条10 m × 100 m的样带，两条样带间隔10 m，在每条样带内随机设置3个10 m × 10 m的样方(每个样方相隔20 m以上)。在不同样带喷施不同浓度的除草剂，分别为对照组(0.00 L/hm2，喷施等量纯净水)和实验组(17.91 L/hm2)。本研究使用的除草剂为25%的咪唑烟酸水剂，由北京绿冠生态科技股份有限公司生产。
样品采集时间为咪唑烟酸喷施前(0 d)和咪唑烟酸喷施后的1 d、3 d、6 d、30 d、60 d和120 d。在每条样带的3个样方分别采集0 ~ 20 cm的土壤。为消除空间异质性导致的差异，将每个样带的3个样品混合后再分成3份，低温运回实验室，保存在−80 ℃的环境中进行微生物测序。

1.3 DNA提取、扩增和测序

本研究使用细菌扩增引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′ )对细菌的16S rRNA基因V4~V5可变区进行扩增；使用真菌扩增引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2F(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)对真菌rRNA基因ITS2区域进行扩增。扩增进行35个循环，通过聚合酶链式反应(PCR)在目标区域扩增产物上添加测序通用接头和样本特异性Barcode序列。通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并采用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收试剂盒对目标片段进行回收。对纯化后的PCR产物添加Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit试剂，然后在Promega QuantiFluor荧光定量系统上对文库进行定量、混库。最后，使用Illumina测序平台PE250按照标准操作进行双端测序。

1.4 测序数据处理

根据双端测序中两端序列互相重叠的区域(overlap)进行下机数据 RawData拼接，并进行质控、嵌合体过滤，从而得到高质量的CleanData。随后通过qiime dada2 denoise-paired调用DADA2对CleanData进行长度过滤和去噪。去噪后使用扩增子序列变异体(Amplicon Sequence Variants，ASVs)的概念构建类OTU表，获得ASV特征表以及特征序列。利用SILVA数据库(https://www.arb-silva.de/)中的NT-16S进行细菌序列物种注释，利用unite数据库(https://unite.ut.ee/)和RDP分类器进行真菌序列物种注释，注释的置信度阈值为0.7。

1.5 数据分析

采用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比较，检验不同处理下微生物指标的差异。利用QIIME2进行微生物多样性和相对丰度计算以及加权unifrac主坐标分析(PCoA)，并基于置换多元方差分析(PERMANOVA)判别不同实验组之间(药剂和时间)微生物群落结构的差异，主要计算指标包括OTUs指数(不同样品中微生物类群的丰富程度)、Shannon指数(微生物的种类数)、Chao1指数(微生物的丰度)和Pielou指数(微生物的均匀度)[16]。为进一步分析喷施咪唑烟酸对土壤微生物群落结构的影响，将不同时间点对照组与实验组的土壤微生物群落进行anosim分析，并基于weighted unifrac方法计算每个时间点与第0 天(喷药前)的结构相似性距离。利用PICRUSt2软件，进行土壤微生物基因功能预测，并基于KEEG数据库对细菌的代谢通路进行富集分析(level 2)，基于MetaCyc数据库对真菌的代谢通路进行富集分析(level 2)。采用双因素方差分析，比较时间变化和药剂处理对微生物多样性(Shannon指数)、群落结构(结构相似性距离)以及功能(富集代谢通路平均占比)的影响。利用R 4.0.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物多样性

无论是否喷施咪唑烟酸，土壤细菌OTUs指数、Shannon指数、Chao1指数和Pielou指数均在第30 天时最大，在第120 天时最小(图1a)。在0~60 d，对照组和实验组细菌多样性随时间的变化差别不大，到第120 天时急剧降低，与其他时间点均差异显著(p<0.05)。但在同一时间不同处理之间细菌多样性指数差异不显著(p>0.05)。双因素方差分析表明(表1)，咪唑烟酸对细菌多样性的影响不显著(p>0.05)，而时间对细菌多样性影响显著(p<0.05)。
1 Temporal changes of soil microbial community diversity under different imazapyr treatments

不同咪唑烟酸处理下土壤微生物群落多样性的时间变化

p<0.05)；不同小写字母表示同一处理不同时间之间差异显著(p<0.05)。]]>

1 Results of two-way ANOVA of time and imazapyr for the soil microbial community

时间和咪唑烟酸处理对土壤微生物群落影响的双因素方差分析

因子F值
细菌真菌
多样性结构功能多样性结构功能
注：*表示p<0.05；***表示p<0.001。
时间173.964***53.861***0.01634.620***2.822*0.837
药剂处理0.27532.722***2.981*0.0240.23418.430***
时间×药剂处理1.2515.906***0.0200.2462.371*0.662
对照组和实验组土壤真菌OTUs指数、Shannon指数、Chao1指数和Pielou指数在第30 天和第60 天时相差不大但远大于其他时间的数值(图1b)。在0~30 d，土壤真菌多样性较低，且时间变化不明显，在30~60 d则显著增高(p<0.05)，而在第120 天时又降低至30 天以前的水平。与细菌一样，同一时间不同处理之间真菌多样性无显著差异(p>0.05)，表明咪唑烟酸对土壤真菌多样性的影响不大，真菌多样性的变化主要受时间影响，该结果与双因素方差分析结果一致(表1)。

2.2 土壤微生物相对丰度

对照组与实验组在不同时间下土壤细菌群落相对丰度大于1%的有17个门类，土壤细菌相对丰度排名前10的门类如图2所示。其中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、绿弯菌门(Chloroflexi)和厚壁菌门(Firmicutes)占主导地位，相对丰度均大于10%，而厚壁菌门只在对照组的第0 天相对丰度大于10%。变形菌门相对丰度随时间均呈现先下降后上升趋势，特别是在第120 天时占据绝对优势(相对丰度>95%)，但在喷施咪唑烟酸后的1~6 d其相对丰度下降较大。放线菌门相对丰度随时间均呈现先上升后下降趋势，在第120 天时相对丰度最低。绿弯菌门相对丰度随时间没有明显变化，但其相对丰度在第120天几乎为0。
2 Temporal changes of relative abundance of soil microbial communities in different phyla under different imazapyr treatments

不同咪唑烟酸处理下不同门类土壤微生物群落相对丰度的时间变化

对照组与实验组不同时间的土壤真菌群落共鉴定出10个门类(图2)。相对丰度大于1%的有5个门类，分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、未分类真菌(Fungi_unclassified)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)。其中子囊菌门占主导地位，在对照组和实验组的相对丰度均大于10%。担子菌门相对丰度在对照组和实验组随时间变化不太一致，但其相对丰度在6 天后均大于10%。未分类真菌相对丰度在不同咪唑烟酸浓度处理下在120 天之前比较稳定，但在第120天相对丰度降至1%以下。接合菌门相对丰度只在喷施咪唑烟酸后第3 天较高(25.94%)，而在未喷施咪唑烟酸的对照组中，其相对丰度在各个时间点几乎为0。

2.3 土壤微生物群落结构

主坐标轴1(PCoA1)和主坐标轴2(PCoA2)对细菌样本的解释度之和均超过60%(图3a)，PERMANOVA检验表明，对照组与实验组细菌群落结构差异不显著(p=0.954)，但都表现出了明显的时间变化(p=0.001)。在0~60 d，细菌群落结构在不同时间点的差异较小，第120天时细菌群落结构与其他时间点差异明显。PCoA1和PCoA2对真菌样本的解释度之和低于细菌(<50%)，对照组与实验组真菌群落结构同样不存在显著差异(p=0.992)，但都表现出显著时间变化(p=0.001)，然而对照组与实验组真菌群落结构随时间变化呈现的差异不如细菌明显(图3b)。
3 Weighted unifrac PCoA analysis of soil microbial communities at different times under different imazapyr treatments

不同咪唑烟酸处理下土壤微生物群落在不同时间点的加权unifrac主坐标轴分析

采用anosim分析研究微生物群落的结构差异(图4)，发现对照组的细菌群落结构在前60天无显著差异(p>0.05)，仅在第120 天时与其他时间点存在显著差异(p<0.05)，而真菌群落在所有时间点之间均无显著差异(p>0.05)。实验组的细菌群落结构在不同时间点差异较大，其中第120天的群落结构与其他时间点之间差异最大。由于真菌群落结构简单，仅在喷药后第3 天与其他时间点差异较大，且只与第0 、1 和6 天的群落结构存在显著差异(p<0.05)。以上结果与双因素方差分析结果较为一致，细菌群落结构受时间、药剂处理以及二者的交互影响(p<0.001)，且时间的影响(F=53.861)要大于药剂处理的影响(F=32.722)；而真菌群落结构主要受时间以及时间和药剂的交互影响(p<0.05)。
4 Temporal changes of similarity distance of soil microbial communities structure under different imazapyr treatments

不同咪唑烟酸处理下土壤微生物群落结构相似性距离的时间变化

p<0.05)。]]>

2.4 土壤微生物群落功能组成

基于KEGG数据库分析，对照组和实验组的细菌群落共富集到24类第二层代谢通路(图5)，但是对照组和实验组代谢通路的平均占比均无显著差异(p>0.05)。对照组和实验组在时间上都富集到4类显著差异代谢通路(p<0.05)，在对照组中有跨膜运输(Membrane Transport)以及折叠、分类和降解(Folding, Sorting and Degradation)两类特异性代谢通路，在实验组中有转录(Transcription)和脂质代谢(Lipid Metabolism)两类特异性代谢通路。虽然整体上对照组与实验组富集到的代谢通路平均占比无显著差异，但二者在时间动态上存在特异性代谢通路，这可能是双因素方差分析结果显示咪唑烟酸对细菌群落功能影响显著(p<0.05)但统计量F值较小的原因。
5 KEGG enriched metabolic pathway (level 2) of soil bacterial communities at different times under different imazapyr treatments

不同咪唑烟酸处理下土壤细菌群落在不同时间点的KEGG富集代谢通路(level 2)

p>0.05。a. 对照组和实验组所有时间点细菌富集代谢通路占比；b. 对照组不同时间点细菌显著差异富集代谢通路占比；c. 实验组不同时间点细菌显著差异富集代谢通路占比。]]>

基于MetaCyc数据库分析，对照组和实验组的真菌群落共富集到4类显著差异代谢通路(p<0.05，图6)。对照组在不同时间点上共富集到4类显著差异代谢通路(p<0.05)，而实验组只富集到2类，且二者的显著差异代谢通路占比的时间变化趋势相反。对照组和实验组均仅有脂肪酸和脂质生物合成(Fatty Acid and Lipid Biosynthesis)代谢通路。真菌的差异代谢通路占比均小于2.5%，但对照组与实验组的显著差异代谢通路以及在时间变化上存在的显著差异代谢通路表明，真菌群落功能受咪唑烟酸的影响显著(p<0.05)，与双因素方差分析结果一致(见表1)。
6 MetaCyc enriched metabolic pathway (level 2) of soil fungal communities at different times under different imazapyr treatments

不同咪唑烟酸处理下土壤真菌群落在不同时间点的MetaCyc富集代谢通路(level2)

p<0.05。A. 对照组和实验组所有时间点真菌富集代谢通路占比；B. 对照组不同时间点真菌显著差异富集代谢通路占比；C. 实验组不同时间点真菌显著差异富集代谢通路占比。]]>

3 讨　论

微生物是对环境因子变化比较敏感的生物群体，当环境条件发生改变时其群落结构一般会随之发生变化。本研究发现，实验组(喷施咪唑烟酸)与对照组(未施咪唑烟酸)土壤微生物多样性的时间变化趋势相似，在30天之前，细菌和真菌群落多样性较为稳定，30~60 d微生物群落多样性增加，而在第120天时急剧下降，微生物多样性的差异存在于不同时间点之间而不存在于实验组与对照组之间。双因素方差分析同样表明，施用咪唑烟酸对土壤细菌和真菌群落多样性的影响不大，这与Mo等[13]的研究结果相似，细菌和真菌群落的多样性主要受时间变化的影响。有研究表明，即使没有其他因素的影响，土壤微生物群落在时间序列上本身就存在演替过程[25]。在德国瓦登海一项长达2年的研究中，研究者发现时间是影响微生物群落(OTUs)的最重要的单一因素，而与大多数环境因子无关，微生物群落OTUs的变化可能是一些未知的随机过程导致的[27]。
虽然实验组与对照组土壤微生物的相对丰度变化大致相同，但是特定的几个门的相对丰度变化较大。在喷施药剂1天后，细菌群落中的变形菌门相对丰度大幅度下降而放线菌门相对丰度增加，在第30天时恢复至与未喷药处理的相似水平，这与孙丽丽等[28]的研究结果类似。在喷施药剂3天后，真菌群落中的接合菌门丰度短暂增加后大幅度降低，同样在第3天时恢复至与未喷药处理相似的水平。有研究表明，咪唑烟酸在环境中的残留量约在第30天时已降解至极低水平[3]，说明喷施咪唑烟酸对大部分微生物类群相对丰度的影响不大，主要对个别微生物类群的相对丰度有所影响。在喷施咪唑烟酸30天前后，咪唑烟酸对互花米草的药效开始显现，互花米草生长和代谢受到阻碍，甚至死亡，这些过程(根系分泌物、共生菌等)直接或间接影响部分土壤微生物类群[29]。
对照组和实验组的微生物群落结构在PCoA分析上没有显著差异，但通过比较对照组和实验组在不同时间点与第0天时的群落结构距离分析可知，对照组细菌群落结构只在第120天与第0天存在显著差异，而真菌群落结构在各时间段间均差异不显著。喷施咪唑烟酸对细菌群落结构影响较大，在多个时间点与第0天存在显著差异；真菌群落结构仅在第3天与第0天存在显著差异，这些结果与双因素方差分析的结果一致。可见在咪唑烟酸治理互花米草过程中，喷施咪唑烟酸对细菌群落结构有显著影响，但对真菌群落结构的影响不明显，可能与真菌种类较少有关。
对照组与实验组的细菌群落整体上不存在差异显著的富集通路，但在2级代谢通路上对照组和实验组的细菌群落在时间上均存在差异富集通路，但这些差异富集通路所占比例均小于15%，表明功能的差异可能是由小部分受咪唑烟酸影响的微生物类群的变化引起的。有研究表明，咪唑烟酸从喷施到释放到环境的残留高峰期在第1~6天[3]。本研究发现，在喷施咪唑烟酸1~6天时微生物群落结构开始发生变化，同时差异富集代谢通路也存在较大波动，双因素方差分析也表明差异富集代谢通路(微生物群落功能)主要受药剂处理的影响。不同微生物对营养的需求存在差异，由地上植被调节的有机质输入可以影响微生物类群的竞争动态以及代谢活性，进而改变微生物群落结构和功能[30]。喷施咪唑烟酸后，随着时间的推移，大部分死亡和倒下的互花米草随着潮汐的运动被转移到很远的地方，阻碍了它们在沉积物表面的堆积和分解[16]，由于缺乏碳、氮等营养元素的来源，进而会影响部分微生物类群的代谢功能[31]。除了地上植被外，海水中的浮游微生物也会影响土壤微生物的多样性、丰富度以及群落功能，而海水中的浮游微生物存在时间变化[32]。虽然本研究表明咪唑烟酸喷施对土壤微生物群落的影响不大，但在滨海湿地生态系统中土壤微生物群落受植被变化的影响更大还是受时间变化的影响更大，仍需开展深入研究。

4 结　论

微生物是湿地生态系统的重要组成部分，探究化学治理互花米草过程中土壤微生物群落的时间变化有利于评估化学药剂的安全性和可用性。本研究表明，喷施咪唑烟酸对土壤微生物多样性的影响不大，微生物多样性主要受时间变化的影响；喷施咪唑烟酸会对微生物类群的相对丰度产生影响进而改变微生物的结构和功能，但咪唑烟酸对细菌群落结构的影响大于真菌，而对真菌群落功能的影响大于细菌。

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